质粒电泳提取

李常月 主任医师 七台河市人民医院 三甲

擅长：擅长普外科尤其对肝胆胰腺，甲状腺和乳腺疾病有独特的见解。擅长于胆囊炎，胆囊结石，结节性甲状腺肿，甲状腺癌肝癌以及结肠癌痔疮，肛裂。

提问

质粒电泳提取前可以进行质粒提取、DNA纯化、PCR扩增、基因测序和基因编辑等处理，以确保准确性和可靠性。
1.质粒提取
质粒提取通常采用试剂盒方法，如Qiagen DNeasy Mini Kit，通过蛋白酶处理、酚-氯仿抽提等步骤从样本中分离出质粒DNA。此步骤旨在去除细胞裂解物中的蛋白质、RNA等杂质，获得高纯度的质粒DNA，为后续分析提供准确信息。
2.DNA纯化
DNA纯化通常使用硫酸铵盐沉淀法，在低浓度硫酸铵条件下使核酸沉淀，然后洗涤沉淀物以除去杂质。该方法利用了不同种类核酸溶解度差异较大这一特性，从而实现核酸的纯化。
3.PCR扩增
PCR扩增包括设计引物、模板制备、PCR反应及产物检测四个步骤，在Taq聚合酶作用下对目标片段进行特异性复制。PCR扩增可用于提高目标序列拷贝数，便于后续分析；其原理是依据双链DNA变性温度低于单链DNA的原则，当温度升高至90℃以上时，DNA双链打开成为单链，再将温度降至50℃左右时，引物可与单链DNA分子相应互补序列结合，形成引物-单链DNA复合体，最后将温度升至72℃左右时，TaqDNA聚合酶就能在引物3'端开始合成新的DNA链。
4.基因测序
基因测序通常采用Sanger测序技术，通过化学方法将DNA片段上的碱基信息读取出来。Sanger测序是一种经典的DNA测序技术，具有较高的准确性，能够有效地检测基因组中的突变位点。
5.基因编辑
基因编辑通常使用CRISPR/Cas9系统，在体外构建sgRNA靶向特定基因区域，将其与Cas9蛋白共转染入细胞内进行基因剪切。CRISPR/Cas9系统是一种高效精准的基因编辑工具，通过识别并切割靶标DNA序列来实现基因功能研究或改造。
在进行质粒电泳提取时，需注意保护样品免受污染，同时确保操作环境无干扰因素，以免影响实验结果的准确性。

陈茵沫 主治医师 三甲

提问

pET系列载体本身不是高拷贝质粒，因此从你说的“直接将pET-2质粒放上去电泳，条带也很微弱”就说明你提取的量就很少，所以显示的比较弱。再酶切以后就更弱了。

建议你从5~10ml比较浓的菌液中再次抽提质粒，首先要达到质粒浓度够高，然后再酶切检测。